随着对陆生生物资源的长期开发利用，从中发现新药或先导化合物的概率大幅下降，新药获得更加困难。因此，人们把目光投向了红树林[1-2]、海洋[3-4]、极地[5-6]和沙漠[7]等特殊生境，拓展了新药发现的范围，这些生境是当前新药发现的重要来源。新药研发的关键是获得新颖结构先导化合物，而产生产量高、结构新颖的活性代谢产物的“天才菌株”(talented strains)是获得先导化合物的前提。 红树林是陆地向海洋过渡的特殊生态系统，相对开放却又复杂，与其他环境间频繁交流，这种特性决定了其真菌资源丰富多样，又极具特色，为新药发现提供了资源。澳大利亚科学家Cribb[8]于1955年首先对红树林真菌进行了报道，近年来我国学者也对红树林真菌做了大量研究，主要集中于内生真菌、腐叶真菌和红树林底泥真菌资源调查[9-10]。 海洋约占地球总面积的70%，构成了世界上最大的微生物资源库[11]。自上世纪60年代开始，人们开始重视海洋天然产物的开发，其中海洋真菌因其次级代谢产物多样性丰富、产量高而成为海洋天然产物开发的重要资源。截止2011年，已从海洋真菌发酵产物中发现了1117 个新的次级代谢产物[12]，为新药研发提供了大量先导化合物[13-14]。如Song等[15]从渤海一株杂色曲霉中分离得到5个新二聚醌类化合物，其中brevianamide S具有选择性抑制牛结核分支杆菌活性，有望成为抗结核病新药。 另外，南北极地区存在许多未知的微生物资源。极地生物资源的开发多集中在极地嗜冷细菌和放线菌的开发利用，而对极地真菌的研究较少[16]，对土壤真菌这一群落的研究更少。Singh等[17]调查了斯匹次卑尔根(Spitsbergen)群岛新奥尔松(Ny-Alesund)地区土壤真菌种类和分布情况，并发现了新种。中国北极黄河科考站真菌的系统调查研究不多，那广水和许丹等对站区附近真菌多样性及产酶活性进行了报道[18-19]。 本实验室前期已经对红树林和北极放线菌进行了多年研究，并从中获得了大量的“天才菌株”及其活性代谢产物[3,20-23]。本研究从红树林、海洋沉积物、北极3种不同生境中采集样品并进行真菌的分离，然后对其代谢产物进行分析，以期获得“天才菌株”，从而获得新的先导化合物。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品的采集 分别采集于泰国红树林和中国南海海域不同深度的海洋沉积物和中国北极黄河科考站附近，采用十字交叉采样法采集样品，立即装入密封采样袋，置于采样冰盒中24h内送回实验室。然后立即进行相关分析，或于4℃冰箱中保存备用。 其中，红树林植物根系土壤样品具体信息如表1。 海洋沉积物样品由“东方红2”南海基金DFH11航次于2011年8月29日—2011年8月31日在中国南海采集，每份样品的编号为其所在站位编号(表2)。 北极土壤样品由中国典型培养物保藏中心彭方博士从北极的4个地点采集，样品信息如表3。 1.1.2 培养基 分离过程中选用6种分离培养基(表4)，鉴别培养基采用Martin培养基，配方与分离培养基配方相同，发酵培养采用玉米培养基。 分离培养基121℃灭菌20min，冷却至50～60℃时加入以下抑制剂：氯霉素50mg/L、硫酸链霉素50mg/L，混匀后倒板。 1.1.3 检定菌 白念珠菌(Candida albicansATCC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC)、大肠埃希菌(Escherichia coliATCC)均由本实验室保藏，检定菌培养基为YPD培养基和LB培养基[24]。 表1 红树林植物根系土壤样品信息Tab. 1 Soil samples information from the mangrove样品编号红树植物中文名拉丁学名1桐花树Aegiceras corniculatum3红树Rhizophorasp. 4卤蕨Acrostichum aureurm5白骨壤Avicennia marina6海桑Sonnaeratiasp. 7白骨壤Avicennia marina8黄槿Hibiscus tiliscus9木榄Bruguieragymnorrhiza10海桑Sonnaeratiasp.红海榄 1.2 方法 1.2.1 真菌的分离纯化及形态学鉴定 采用稀释平板分离法对土壤样品进行真菌分离。先将采集的土壤样品除去杂质，然后分别称取1g土壤样品置于装有9mL无菌水的试管中，在涡旋振荡器上混匀，置于200r/min的摇床上振荡30min，然后稀释成10–1、10–2和10–33个梯度，每个稀释梯度设2个平行，取100μL涂布于分离培养基上，置于28℃培养箱中培养并定期观察。将不同的菌落分别在Martin培养基平板上划线稀释，然后纯化保存。观察各菌株的形态特征，参考《真菌鉴定手册》[25]、《真菌的形态和分类》[26]和《中国真菌志》[27]等，进行形态学分类和排重。 1.2.2 分离菌株的发酵培养 将分离并排重后获得的菌株接种到装有10g玉米固体发酵培养基的50mL三角瓶中，28℃，静止培养18d。然后取发酵产物加入15mL无水甲醇，使之浸没培养基，搅拌打散，放置过夜；再超声处理30min，r/min离心5min，取上清液4℃保存，用作后期活性检测。 表2 海洋沉积物信息Tab. 2 Marine sediments information站位水深/m经度纬度抵站时间离站时间原站位. 18:-8-29 19:3631 .3321.-8-29 22:1-8-29 22:5530 .4221.-8-30 0:5-8-30 1:5329 .6720.-8-30 8:002011-8-30 10:.0420.-8-30 19:-8-30 20:3827.2 .9321.-8-30 23:0-8-31 0:3027.3 . 2:-8-31 3:2627.4 .7521.-8-31 5:-8-31 7:2832 .2021.-8-31 10:-8-31 11:2533 .3021.-8-31 13:-8-31 14:2234 . 16:-8-31 18:.5020.-8-31 20:-8-31 21:3636 .6119.-9-1 0:-9-1 1:4237 . 7:-9-2 16:2578 表3 北极土样的来源Tab. 3 Information of arctic soil samples编号经纬度海拔/m时间地点原始编号N578°13'12.11" /15°20'3.69"-7朗伊尔海冰退却区Y3 N678°10'42.92"/15°42'26.86"-7朗伊尔5号矿前冰积圈内Y4A N778°55'847" /12°13'323"-7鸟岛低洼处10号N878°55'8.67" /12°12'978"-7鸟岛较高处11号 表4 本实验所使用的培养基及其配方Tab. 4 Formula of media used in this study培养基种类培养基配方GPY培养基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉10g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L，pH7.5 Martin培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，，孟加拉红0.03g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L CA培养基蔗糖30g，海盐15g，琼脂20g，NaNO33g，K2HPO41g，KCl 0.5g，，，dd H2O 1L PDA培养基马铃薯浸粉5g，葡萄糖20g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L SDA培养基葡萄糖40g，蛋白胨10g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L，pH6.0真菌Ⅱ号培养基葡萄糖10g，甘露醇20g，麦芽糖20g，谷氨酸钠10g，酵母浸粉3g，玉米浆1g，海盐15g，琼脂20g，，， dd H2O 1 L，pH6.5玉米培养基玉米 50g，酵母浸粉 0.86g，酒石酸铵 2.37g，，，海盐 0.4g，dd H2O 20mL YPD培养基酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，dd H2O 1 L，pH5.0～5.5 LB培养基酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，琼脂20g，NaCl 10g，dd H2O 1 L，pH7.2～7.4 1.2.3 发酵粗提物抗菌活性检测 (1)检定菌培养：将白念珠菌(Candida albicansATCC)接种到YPD液体培养基中，28℃，200r/min培养17～24h，用于抗真菌活性检测。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC)、大肠埃希菌(Escherichia coliATCC)2种检定菌接种到LB液体培养基中，37℃，200r/min培养12～16h，用于抗细菌活性检测。 (2)抗菌活性检测：采用Kirby-Bauer纸片扩散法，对发酵粗提液进行抗菌活性检测。吸取100μL检定菌液接种到相应培养基上并涂布均匀；吸取20μL发酵粗提液到无菌滤纸片上，待晾干后将滤纸片贴到固体平板上；倒置培养12～24h后观察结果并测量抑菌圈直径。 1.2.4 菌株发酵粗提物多样性检测 先用0.22μm微孔滤膜器对发酵粗提液过滤，然后进行HPLC(Waters 2998，美国Waters公司)检测。HPLC分析条件：色谱柱：SinoChrom ODSBP(250nm×4.6nm, 5μm)；A：超纯水；B：色谱级甲醇；0min 10%B，15min 100%B，20min 100%B，21min 10% B，25min 10%B；流速：1.0mL/min；检测波长：全波长扫描；进样量20μL，先在全波长条件下观察吸收峰的特点和保留时间，再对各个特征吸收峰进行分析。 2 结果与分析 2.1 真菌的分离 对采集自泰国红树林(n=10)、海洋沉积物(n=14)和北极(n=4)的28份土壤样品进行分离，通过形态学观察对分离所得的菌株进行初步排重，总共获得真菌192株，从这3种生境分别获得真菌117、47和37株(图1)。 从分离结果可以发现以下特征：(1)不同地点相同分离培养基与培养条件分离得到的真菌数量不同，其中红树林分离得到的真菌数量最多，北极次之，海洋沉积物最少。(2)相同生境不同样品分离得到的真菌数量也不相同。(3)红树林生境中同种植物根系土壤样品分离到的菌株数大致相同。 红树林生境出菌率最高，平均每份样品能够分离11.7株真菌，海洋沉积物最低，有些样品甚至没有分离获得真菌(表5)。 图1 不同样品分离到的真菌数量Fig. 1 The amount of isolates from different samplea：红树林；b：北极； c：海洋沉积物 2.2 发酵粗提物的抗菌活性检测 对分离所得菌株采用玉米固体发酵培养基进行培养，经处理后对其发酵粗提物进行抗菌活性检测。在所有活性检定菌株中：具有抗Staphylococcus aureusATCC活性的最多，达67株；具有抗Escherichia coliATCC活性的有4株；具有抗Candida albicansATCC活性的仅有2株。 在3种检定菌活性筛选中，红树林生境分离获得的真菌抗菌活性菌株最多，海洋沉积物次之，北极最少(图2)。在抗细菌Staphylococcus aureusATCC活性检测中，3种生境中都分离得到一部分具有抑菌活性的菌株，其中红树林生境最多；在抗细菌Escherichia coliATCC活性检测中，仅从红树林和海洋沉积物两种生境中各分离出2株具有活性的真菌；在抗真菌Candida albicansATCC活性检测中，仅有2株分离自红树林的真菌发酵粗提物有抑制活性。活性菌株占该生境所分离菌株比例分别为红树林6.8%，海洋沉积物6.4%%。虽然红树林和海洋沉积物分离所得比例相当，但红树林生境分离得到的菌株数量远多于海洋沉积物。 表5 不同生境分离真菌的数量Tab. 5 Numbers of strains isolated from different samples样品来源样品数量菌株数量出菌率/%红树林.7海洋沉积物.36北极4379.25 图2 抗菌活性检测结果Fig. 2 The result of antibiotic actives 2.3 发酵粗提物的HPLC检测 挑取抗菌活性检测中具有活性的发酵粗提物，经微孔滤膜过滤后进行HPLC检测，观察各样品的紫外吸收峰特点。从泰国红树林、海洋沉积物、北极3个环境中分别得到8、3和1株能够产生一系列类似特征吸收峰的菌株。 其中分离自红树林的DM62发酵粗提物代谢产物最丰富，在254nm处可以看到一系列类似特征吸收峰，其中有4个类似吸收峰的最大紫外吸收在307nm处，有7个类似吸收峰的最大紫外吸收在279nm处，并且具有较高的抗Staphylococcus aureusATCC活性，有望获得新的活性代谢产物(图3)。 综合比较3种不同生境中具有一系列类似特征吸收峰的产生菌株及其抗菌活性，结果如表6。红树林生境中能产生一系列类似特征吸收峰的菌株数量最多，类似特征吸收峰数量也最多；海洋沉积物仅有3株真菌能够产生一系列类似特征吸收峰，类似特征吸收峰数量在3～5之间；北极生境中只有1株真菌能够一系列类似特征吸收峰，有5个类似特征吸收峰。 从表6可以看出，分离自红树林生境的8株能够产生一系列类似特征吸收峰的真菌不仅具有抗Staphylococcus aureusATCC活性，还有1株具有Candida albicansATCC和Escherichia coliATCC活性，而且该生境的真菌次级代谢产物更丰富，有望获得新化合物。3株分离自海洋沉积物的能产生一系列类似特征吸收峰的菌株都具有较好的抗Staphylococcus aureusATCC活性，而没有另外两株检定菌抗性；分离自北极的唯一一株能够产生一系列类似特征吸收峰的菌株只有较弱的抗Staphylococcus aureusATCC 活性。 4 讨论 不同生境中微生物的类群可能不同：红树林真菌种类丰富，并且常常有新颖的活性化合物的报道[1]；海洋生境由于处于低温、高压和低光线等环境，真菌种类和数量都并不多，主要为子囊菌与担子菌类以及大量属于这2个门的酵母；北极地区常年寒冷干燥，微生物数量比较有限，活性菌株也比较少。 分离条件的选择过程中，要充分考虑到分离生境的特点，需要先对分离条件进行摸索。比如北极地区土壤真菌分离过程中，尝试了不同培养温度对分离效率的影响，发现虽然北极土壤温度较低，但在28℃的分离效率最高[28]。 综合来看，红树林生境分离效果最好，虽然红树林和海洋沉积物中活性菌株分离比例相当，但红树林分离所得真菌数量远多于海洋沉积物；另外代谢产物多样性方面，红树林代谢产物更加丰富。 另外，本课题组也对该红树林生境和北极生境样品进行了放线菌分离，发现真菌数量丰富的生境放线菌数量也比较丰富。在红树林生境真菌分离中：从卤蕨(14株)、海桑(16和14株)、黄槿(16株)、白骨壤(11和12株)分离得到的菌株数量最多，分别占该生境分离菌株总数的12%、12.8%、13.7%和9.8%；在红树林生境放线菌分离中：卤蕨(5株)、海桑(29和41株)、黄槿(88株)和白骨壤(44和64株)，分别占该生境分离菌株总数的1.6%、11.4%、28.8%和17.6%。除了卤蕨中分离放线菌数量与真菌相差较大外，其余样品分离获得的放线菌比例与真菌分离比例比较相似[29]。从北极生境4份样品中共分离出37株真菌：其中N5(13株)、N6(4株)、N7(10株)和N8壤(10株)，分别占该生境分离菌株总数的35.1%、10.8%、27%和27%；北极生境中共分离出38株放线菌，其中N5(15株)、N6(0株)、N7(14株)和N8(9株)分别占该生境分离菌株总数的39.5%、0、36.8%和23.7%。除了N6样品中分离放线菌数量与真菌相差较大外，其余样品分离获得的放线菌比例与真菌分离比例比较相似，而N6样品所分离的真菌数量是最少的，没有分到放线菌[28]。由此可以推测：同一生境的微生物数量具有一致性，放线菌含量丰富的生境真菌含量也比较丰富。 图3 DM62发酵粗提物HPLC分析图Fig. 3 Chromatogram of uncertain novel compounds produced by DM62注：a：254nm处的色谱图；b：13.2～15.4min内的系列吸收图谱；c：14.9～17.8min内的系列吸收图谱 表6 3种生境抗菌真菌活性及代谢产物分布表Tab. 6 The result of antimicrobial antifungal activity and metabolites of three biotopes注：抗菌活性标准说明：当抑菌圈直径在6～10mm内，活性强度定义为“+”；当抑菌圈直径在10～15mm内，活性强度定义为“++”；当抑菌圈直径在15mm以上，活性强度定义为“+++”编号抗S. auraus活性抗E. coil活性抗C. albicans活性同系物数量来源DM27+--4红树林DM29+--8红树林DM46-++6红树林DM55+--6红树林DM62++--11红树林DM74+--5红树林DM815+--7红树林DM94++--9红树林YJJ41++--4海洋沉积物YJJ40++--5海洋沉积物YJJ11++--3海洋沉积物N512+--5北极 致谢：感谢武汉大学药学院本科生钟宇婷、刘洋、王雪萌和王璇璇协助菌株分离。 随着对陆生生物资源的长期开发利用，从中发现新药或先导化合物的概率大幅下降，新药获得更加困难。因此，人们把目光投向了红树林[1-2]、海洋[3-4]、极地[5-6]和沙漠[7]等特殊生境，拓展了新药发现的范围，这些生境是当前新药发现的重要来源。新药研发的关键是获得新颖结构先导化合物，而产生产量高、结构新颖的活性代谢产物的“天才菌株”(talented strains)是获得先导化合物的前提。 红树林是陆地向海洋过渡的特殊生态系统，相对开放却又复杂，与其他环境间频繁交流，这种特性决定了其真菌资源丰富多样，又极具特色，为新药发现提供了资源。澳大利亚科学家Cribb[8]于1955年首先对红树林真菌进行了报道，近年来我国学者也对红树林真菌做了大量研究，主要集中于内生真菌、腐叶真菌和红树林底泥真菌资源调查[9-10]。 海洋约占地球总面积的70%，构成了世界上最大的微生物资源库[11]。自上世纪60年代开始，人们开始重视海洋天然产物的开发，其中海洋真菌因其次级代谢产物多样性丰富、产量高而成为海洋天然产物开发的重要资源。截止2011年，已从海洋真菌发酵产物中发现了1117 个新的次级代谢产物[12]，为新药研发提供了大量先导化合物[13-14]。如Song等[15]从渤海一株杂色曲霉中分离得到5个新二聚醌类化合物，其中brevianamide S具有选择性抑制牛结核分支杆菌活性，有望成为抗结核病新药。 另外，南北极地区存在许多未知的微生物资源。极地生物资源的开发多集中在极地嗜冷细菌和放线菌的开发利用，而对极地真菌的研究较少[16]，对土壤真菌这一群落的研究更少。Singh等[17]调查了斯匹次卑尔根(Spitsbergen)群岛新奥尔松(Ny-Alesund)地区土壤真菌种类和分布情况，并发现了新种。中国北极黄河科考站真菌的系统调查研究不多，那广水和许丹等对站区附近真菌多样性及产酶活性进行了报道[18-19]。 本实验室前期已经对红树林和北极放线菌进行了多年研究，并从中获得了大量的“天才菌株”及其活性代谢产物[3,20-23]。本研究从红树林、海洋沉积物、北极3种不同生境中采集样品并进行真菌的分离，然后对其代谢产物进行分析，以期获得“天才菌株”，从而获得新的先导化合物。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品的采集 分别采集于泰国红树林和中国南海海域不同深度的海洋沉积物和中国北极黄河科考站附近，采用十字交叉采样法采集样品，立即装入密封采样袋，置于采样冰盒中24h内送回实验室。然后立即进行相关分析，或于4℃冰箱中保存备用。 其中，红树林植物根系土壤样品具体信息如表1。 海洋沉积物样品由“东方红2”南海基金DFH11航次于2011年8月29日—2011年8月31日在中国南海采集，每份样品的编号为其所在站位编号(表2)。 北极土壤样品由中国典型培养物保藏中心彭方博士从北极的4个地点采集，样品信息如表3。 1.1.2 培养基 分离过程中选用6种分离培养基(表4)，鉴别培养基采用Martin培养基，配方与分离培养基配方相同，发酵培养采用玉米培养基。 分离培养基121℃灭菌20min，冷却至50～60℃时加入以下抑制剂：氯霉素50mg/L、硫酸链霉素50mg/L，混匀后倒板。 1.1.3 检定菌 白念珠菌(Candida albicansATCC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC)、大肠埃希菌(Escherichia coliATCC)均由本实验室保藏，检定菌培养基为YPD培养基和LB培养基[24]。 表1 红树林植物根系土壤样品信息Tab. 1 Soil samples information from the mangrove样品编号红树植物中文名拉丁学名1桐花树Aegiceras corniculatum3红树Rhizophorasp. 4卤蕨Acrostichum aureurm5白骨壤Avicennia marina6海桑Sonnaeratiasp. 7白骨壤Avicennia marina8黄槿Hibiscus tiliscus9木榄Bruguieragymnorrhiza10海桑Sonnaeratiasp.红海榄 1.2 方法 1.2.1 真菌的分离纯化及形态学鉴定 采用稀释平板分离法对土壤样品进行真菌分离。先将采集的土壤样品除去杂质，然后分别称取1g土壤样品置于装有9mL无菌水的试管中，在涡旋振荡器上混匀，置于200r/min的摇床上振荡30min，然后稀释成10–1、10–2和10–33个梯度，每个稀释梯度设2个平行，取100μL涂布于分离培养基上，置于28℃培养箱中培养并定期观察。将不同的菌落分别在Martin培养基平板上划线稀释，然后纯化保存。观察各菌株的形态特征，参考《真菌鉴定手册》[25]、《真菌的形态和分类》[26]和《中国真菌志》[27]等，进行形态学分类和排重。 1.2.2 分离菌株的发酵培养 将分离并排重后获得的菌株接种到装有10g玉米固体发酵培养基的50mL三角瓶中，28℃，静止培养18d。然后取发酵产物加入15mL无水甲醇，使之浸没培养基，搅拌打散，放置过夜；再超声处理30min，r/min离心5min，取上清液4℃保存，用作后期活性检测。 表2 海洋沉积物信息Tab. 2 Marine sediments information站位水深/m经度纬度抵站时间离站时间原站位. 18:-8-29 19:3631 .3321.-8-29 22:1-8-29 22:5530 .4221.-8-30 0:5-8-30 1:5329 .6720.-8-30 8:002011-8-30 10:.0420.-8-30 19:-8-30 20:3827.2 .9321.-8-30 23:0-8-31 0:3027.3 . 2:-8-31 3:2627.4 .7521.-8-31 5:-8-31 7:2832 .2021.-8-31 10:-8-31 11:2533 .3021.-8-31 13:-8-31 14:2234 . 16:-8-31 18:.5020.-8-31 20:-8-31 21:3636 .6119.-9-1 0:-9-1 1:4237 . 7:-9-2 16:2578 表3 北极土样的来源Tab. 3 Information of arctic soil samples编号经纬度海拔/m时间地点原始编号N578°13'12.11" /15°20'3.69"-7朗伊尔海冰退却区Y3 N678°10'42.92"/15°42'26.86"-7朗伊尔5号矿前冰积圈内Y4A N778°55'847" /12°13'323"-7鸟岛低洼处10号N878°55'8.67" /12°12'978"-7鸟岛较高处11号 表4 本实验所使用的培养基及其配方Tab. 4 Formula of media used in this study培养基种类培养基配方GPY培养基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉10g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L，pH7.5 Martin培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，，孟加拉红0.03g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L CA培养基蔗糖30g，海盐15g，琼脂20g，NaNO33g，K2HPO41g，KCl 0.5g，，，dd H2O 1L PDA培养基马铃薯浸粉5g，葡萄糖20g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L SDA培养基葡萄糖40g，蛋白胨10g，海盐15g，琼脂20g，dd H2O 1L，pH6.0真菌Ⅱ号培养基葡萄糖10g，甘露醇20g，麦芽糖20g，谷氨酸钠10g，酵母浸粉3g，玉米浆1g，海盐15g，琼脂20g，，， dd H2O 1 L，pH6.5玉米培养基玉米 50g，酵母浸粉 0.86g，酒石酸铵 2.37g，，，海盐 0.4g，dd H2O 20mL YPD培养基酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，dd H2O 1 L，pH5.0～5.5 LB培养基酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，琼脂20g，NaCl 10g，dd H2O 1 L，pH7.2～7.4 1.2.3 发酵粗提物抗菌活性检测 (1)检定菌培养：将白念珠菌(Candida albicansATCC)接种到YPD液体培养基中，28℃，200r/min培养17～24h，用于抗真菌活性检测。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC)、大肠埃希菌(Escherichia coliATCC)2种检定菌接种到LB液体培养基中，37℃，200r/min培养12～16h，用于抗细菌活性检测。 (2)抗菌活性检测：采用Kirby-Bauer纸片扩散法，对发酵粗提液进行抗菌活性检测。吸取100μL检定菌液接种到相应培养基上并涂布均匀；吸取20μL发酵粗提液到无菌滤纸片上，待晾干后将滤纸片贴到固体平板上；倒置培养12～24h后观察结果并测量抑菌圈直径。 1.2.4 菌株发酵粗提物多样性检测 先用0.22μm微孔滤膜器对发酵粗提液过滤，然后进行HPLC(Waters 2998，美国Waters公司)检测。HPLC分析条件：色谱柱：SinoChrom ODSBP(250nm×4.6nm, 5μm)；A：超纯水；B：色谱级甲醇；0min 10%B，15min 100%B，20min 100%B，21min 10% B，25min 10%B；流速：1.0mL/min；检测波长：全波长扫描；进样量20μL，先在全波长条件下观察吸收峰的特点和保留时间，再对各个特征吸收峰进行分析。 2 结果与分析 2.1 真菌的分离 对采集自泰国红树林(n=10)、海洋沉积物(n=14)和北极(n=4)的28份土壤样品进行分离，通过形态学观察对分离所得的菌株进行初步排重，总共获得真菌192株，从这3种生境分别获得真菌117、47和37株(图1)。 从分离结果可以发现以下特征：(1)不同地点相同分离培养基与培养条件分离得到的真菌数量不同，其中红树林分离得到的真菌数量最多，北极次之，海洋沉积物最少。(2)相同生境不同样品分离得到的真菌数量也不相同。(3)红树林生境中同种植物根系土壤样品分离到的菌株数大致相同。 红树林生境出菌率最高，平均每份样品能够分离11.7株真菌，海洋沉积物最低，有些样品甚至没有分离获得真菌(表5)。 图1 不同样品分离到的真菌数量Fig. 1 The amount of isolates from different samplea：红树林；b：北极； c：海洋沉积物 2.2 发酵粗提物的抗菌活性检测 对分离所得菌株采用玉米固体发酵培养基进行培养，经处理后对其发酵粗提物进行抗菌活性检测。在所有活性检定菌株中：具有抗Staphylococcus aureusATCC活性的最多，达67株；具有抗Escherichia coliATCC活性的有4株；具有抗Candida albicansATCC活性的仅有2株。 在3种检定菌活性筛选中，红树林生境分离获得的真菌抗菌活性菌株最多，海洋沉积物次之，北极最少(图2)。在抗细菌Staphylococcus aureusATCC活性检测中，3种生境中都分离得到一部分具有抑菌活性的菌株，其中红树林生境最多；在抗细菌Escherichia coliATCC活性检测中，仅从红树林和海洋沉积物两种生境中各分离出2株具有活性的真菌；在抗真菌Candida albicansATCC活性检测中，仅有2株分离自红树林的真菌发酵粗提物有抑制活性。活性菌株占该生境所分离菌株比例分别为红树林6.8%，海洋沉积物6.4%%。虽然红树林和海洋沉积物分离所得比例相当，但红树林生境分离得到的菌株数量远多于海洋沉积物。 表5 不同生境分离真菌的数量Tab. 5 Numbers of strains isolated from different samples样品来源样品数量菌株数量出菌率/%红树林.7海洋沉积物.36北极4379.25 图2 抗菌活性检测结果Fig. 2 The result of antibiotic actives 2.3 发酵粗提物的HPLC检测 挑取抗菌活性检测中具有活性的发酵粗提物，经微孔滤膜过滤后进行HPLC检测，观察各样品的紫外吸收峰特点。从泰国红树林、海洋沉积物、北极3个环境中分别得到8、3和1株能够产生一系列类似特征吸收峰的菌株。 其中分离自红树林的DM62发酵粗提物代谢产物最丰富，在254nm处可以看到一系列类似特征吸收峰，其中有4个类似吸收峰的最大紫外吸收在307nm处，有7个类似吸收峰的最大紫外吸收在279nm处，并且具有较高的抗Staphylococcus aureusATCC活性，有望获得新的活性代谢产物(图3)。 综合比较3种不同生境中具有一系列类似特征吸收峰的产生菌株及其抗菌活性，结果如表6。红树林生境中能产生一系列类似特征吸收峰的菌株数量最多，类似特征吸收峰数量也最多；海洋沉积物仅有3株真菌能够产生一系列类似特征吸收峰，类似特征吸收峰数量在3～5之间；北极生境中只有1株真菌能够一系列类似特征吸收峰，有5个类似特征吸收峰。 从表6可以看出，分离自红树林生境的8株能够产生一系列类似特征吸收峰的真菌不仅具有抗Staphylococcus aureusATCC活性，还有1株具有Candida albicansATCC和Escherichia coliATCC活性，而且该生境的真菌次级代谢产物更丰富，有望获得新化合物。3株分离自海洋沉积物的能产生一系列类似特征吸收峰的菌株都具有较好的抗Staphylococcus aureusATCC活性，而没有另外两株检定菌抗性；分离自北极的唯一一株能够产生一系列类似特征吸收峰的菌株只有较弱的抗Staphylococcus aureusATCC 活性。 4 讨论 不同生境中微生物的类群可能不同：红树林真菌种类丰富，并且常常有新颖的活性化合物的报道[1]；海洋生境由于处于低温、高压和低光线等环境，真菌种类和数量都并不多，主要为子囊菌与担子菌类以及大量属于这2个门的酵母；北极地区常年寒冷干燥，微生物数量比较有限，活性菌株也比较少。 分离条件的选择过程中，要充分考虑到分离生境的特点，需要先对分离条件进行摸索。比如北极地区土壤真菌分离过程中，尝试了不同培养温度对分离效率的影响，发现虽然北极土壤温度较低，但在28℃的分离效率最高[28]。 综合来看，红树林生境分离效果最好，虽然红树林和海洋沉积物中活性菌株分离比例相当，但红树林分离所得真菌数量远多于海洋沉积物；另外代谢产物多样性方面，红树林代谢产物更加丰富。 另外，本课题组也对该红树林生境和北极生境样品进行了放线菌分离，发现真菌数量丰富的生境放线菌数量也比较丰富。在红树林生境真菌分离中：从卤蕨(14株)、海桑(16和14株)、黄槿(16株)、白骨壤(11和12株)分离得到的菌株数量最多，分别占该生境分离菌株总数的12%、12.8%、13.7%和9.8%；在红树林生境放线菌分离中：卤蕨(5株)、海桑(29和41株)、黄槿(88株)和白骨壤(44和64株)，分别占该生境分离菌株总数的1.6%、11.4%、28.8%和17.6%。除了卤蕨中分离放线菌数量与真菌相差较大外，其余样品分离获得的放线菌比例与真菌分离比例比较相似[29]。从北极生境4份样品中共分离出37株真菌：其中N5(13株)、N6(4株)、N7(10株)和N8壤(10株)，分别占该生境分离菌株总数的35.1%、10.8%、27%和27%；北极生境中共分离出38株放线菌，其中N5(15株)、N6(0株)、N7(14株)和N8(9株)分别占该生境分离菌株总数的39.5%、0、36.8%和23.7%。除了N6样品中分离放线菌数量与真菌相差较大外，其余样品分离获得的放线菌比例与真菌分离比例比较相似，而N6样品所分离的真菌数量是最少的，没有分到放线菌[28]。由此可以推测：同一生境的微生物数量具有一致性，放线菌含量丰富的生境真菌含量也比较丰富。 图3 DM62发酵粗提物HPLC分析图Fig. 3 Chromatogram of uncertain novel compounds produced by DM62注：a：254nm处的色谱图；b：13.2～15.4min内的系列吸收图谱；c：14.9～17.8min内的系列吸收图谱 表6 3种生境抗菌真菌活性及代谢产物分布表Tab. 6 The result of antimicrobial antifungal activity and metabolites of three biotopes注：抗菌活性标准说明：当抑菌圈直径在6～10mm内，活性强度定义为“+”；当抑菌圈直径在10～15mm内，活性强度定义为“++”；当抑菌圈直径在15mm以上，活性强度定义为“+++”编号抗S. auraus活性抗E. coil活性抗C. albicans活性同系物数量来源DM27+--4红树林DM29+--8红树林DM46-++6红树林DM55+--6红树林DM62++--11红树林DM74+--5红树林DM815+--7红树林DM94++--9红树林YJJ41++--4海洋沉积物YJJ40++--5海洋沉积物YJJ11++--3海洋沉积物N512+--5北极 致谢：感谢武汉大学药学院本科生钟宇婷、刘洋、王雪萌和王璇璇协助菌株分离。

文章来源：《北极光》 网址: http://www.bjgzzs.cn/qikandaodu/2021/0610/751.html